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| 三七总皂甙对吗啡戒断大鼠海马磷酸化CREB蛋白表达及CREB/DNA结合活性的影响 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-9-30  |
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【关键词】 吗啡依赖 Effects of Panax Notoginseng on phosphorylated CREB protein expression and CREB/DNA binding activity in hippocampus of morphine withdrawal rats 【Abstract】 AIM: To investigate the effects of Panax Notoginseng (PNS) on the expressions of CREB, phosphorylated CREB (pCREB) and CREB/DNA binding activity in hippocampus of the morphine dependent rats and the naloxoneprecipitated withdrawal syndrome rats, and to explore the mechanism by which PNS inhibits the morphine withdrawal symptom in rats. METHODS: The models of morphine physical dependent rats and withdrawal syndrome were established by subcutaneous injection of morphine in gradually increasing doses and abdominal cavity injection of naloxone respectively. The rats were treated with PNS by intragastric administration at various doses simultaneously when administrated with morphine. The effects of morphine on the expressions of CREB, pCREB, CREB/DNA binding activity in hippocampus were detected by Western blot and electrophoresis mobility shift assay (EMSA). RESULTS: ①The CREB protein expression in hippocampus was not significantly statistically different in morphine physical dependent group (MOR), naloxone precipitated withdrawal group (NAL) and PNS groups compared with control group (P>0.05); ②The pCREB protein expression and CREB/DNA binding activity in hippocampus were not significantly increased in MOR compared with control group and were significantly increased in NAL compared with MOR and control groups; ③PNS could dosedependently downregulate the increased expression of pCREB and CREB/DNA binding activity in hippocampus induced by naloxoneprecipitated withdrawal. CONCLUSION: PNS could inhibit the expression of pCREB and CREB/DNA binding activity in hippocampus in a dosedependent manner. 【Keywords】 Panax Notoginseng; morphine dependence; naloxone; substance withdrawal syndrome; pCREB 【摘要】 目的: 研究三七总皂甙（PNS）对吗啡依赖及纳络酮催促戒断大鼠海马组织CREB，pCREB蛋白表达及CREB/DNA结合活性的影响，探讨PNS抑制吗啡戒断症状的作用机制. 方法：应用剂量递增法皮下注射盐酸吗啡建立吗啡躯体依赖模型，采用腹腔注射纳络酮建立催促戒断模型，大鼠在给予吗啡的同时，采用4种不同剂量PNS进行灌胃. 采用Western blot和电泳迁移率改变分析法(EMSA)分别观察PNS对吗啡依赖及戒断大鼠海马组织总CREB，pCREB蛋白表达及CREB/DNA结合活性的影响. 结果：①不同剂量PNS组、吗啡成瘾（MOR）组及纳络酮催促戒断(NAL)组大鼠海马组织总CREB蛋白表达与对照组相比无显著性差异（P>0.05）；②MOR组pCREB蛋白表达及CREB/DNA结合活性数值略高于对照组（P>0.05），NAL组pCREB蛋白表达及CREB/DNA结合活性数值明显高于对照组和MOR组（P<0.01）；③PNS可以剂量依赖性的抑制纳络酮催促戒断所引起的pCREB蛋白表达增高和CREB/DNA结合活性的增强. 结论：PNS可以剂量依赖的抑制吗啡成瘾及纳络酮催促戒断诱导的大鼠海马组织CREB磷酸化和CREB/DNA结合活性的增强. 【关键词】 三七总皂甙；吗啡依赖；纳络酮;物质戒断综合症；磷酸化CREB 0引言 三七(Panax notoginseng (Burk)F1H1Chen)为五加科植物，现已从不同部位分离得到数十种单体皂甙成份，其中三七总皂苷（Panax Notoginseng，PNS）是三七的主要生物活性成份，具有活血化淤、抗氧化、抑制细胞内Ca超载、改善学习记忆、调节神经系统、增加免疫功能等功效，是一种非特异性钙拮抗剂. 关于PNS对吗啡成瘾大鼠戒断综合症的研究国内外至今尚未见报道. 我们研究了PNS对吗啡依赖及戒断大鼠核转录因子CREB磷酸化以及DNA结合活性的影响，探讨PNS在戒毒方面的应用及机理. 1材料和方法 1.1材料健康雄性SD大鼠42只，体质量200～220 g，华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，合格证号19020；盐酸吗啡(morphine hydrochloride，MOR)，沈阳第一制药厂生产，批号：辽宁药准字(1996)第002747号. 盐酸纳络酮、氨基甲酸乙酯、亮肽素(leupeptin)(美国Sigma公司)；CREB及pCREB抗体(美国Santa Cruz公司). PNS(天津天士力联合制药股份有限公司提供)，EMSA试剂盒(美国Promega)，［γ32P］ATP(北京福瑞生物公司)，MultiphorⅡ多功能电泳系统. 凝胶成像分析仪（美国UVP公司）. 1.2方法 1.2.1动物模型的制作及分组模型鼠随机分为对照组（Control），吗啡依赖组（MOR），纳络酮催促戒断组（NAL）和PNS50，PNS100，PNS200，PNS400组（PNS50，100，200，400 mg/kg治疗组），每组6只. MOR组、NAL组和PNS组参照文献记载以剂量递增法连续5 d背部皮下给予（sc）吗啡的方法建立吗啡依赖大鼠模型. 首日吗啡20 mg/kg，分2次(sc)(8:00，18:00). 以后每日增加20 mg/kg，第5日吗啡每次用量达50 mg/kg. 第6日上午8:00末次注射吗啡50 mg/kg. NAL组和PNS组在末次注射吗啡2 h后皮下注射纳络酮5 mg/kg. PNS50，PNS100，PNS200，PNS400组在给予吗啡的同时分别按50，100，200，400 mg/kg剂量进行灌胃. 对照组在相同时间注射生理盐水. 1.2.2Western blot检测CREB及pCREB蛋白表达每组大鼠取6只, 麻醉后在冰台上取出大脑，冰浴下分离海马，依照文献［1］加入预冷提取缓冲液进行匀浆. 4℃离心(12 000 g，5 min)，取上清，置－70℃低温冰箱中保存，供测定总CREB和pCREB水平. 用考马斯亮兰G250试剂盒测定每一组样品蛋白浓度. 各组取蛋白200 μg，电泳分离后电转移至硝酸纤维素（NC）膜. 将膜置于50 g/L脱脂奶粉封闭1 h，分别加兔抗大鼠非磷酸化的CREB1和羊抗大鼠pCREB抗体，4℃孵育过夜，TBS洗膜后，分别加入HRP标记的IgG二抗，37℃孵育1 h，TBS洗膜后采用化学发光法检测结果，以βactin作为内参对照. 上述实验重复3次. 用ScionImage软件对结果进行半定量分析，用AU（Darea・Ddensity）代表条带的面积×光密度值，以CREB/βactin和pCREB/βactin的AU比值代表的CREB和pCREB相对含量. 1.2.3EMSA检测CREB/DNA结合活性方法同上分离海马，提取组织核蛋白,测定CREB/DNA结合活性. 用考马斯亮兰G250试剂盒测定每一组样品蛋白浓度. 含有CREB特异性识别位点的双链脱氧寡核苷酸为：5′AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG3′和5′CTAGCTCTCTGACGTCAGGCAATCTCT3′，用T4多核苷酸激酶进行末端标记［γ32P］ATP，乙醇沉淀法纯化标记的寡核苷酸. 取50 μg核蛋白与同位素标记的DNA探针(3.5 pmol, 10 μCi)在室温下进行结合反应30 min，反应成份包括：1 mmol/L MgCl2, 0.5 mmol/L EDTA, 0.5 mmol/L DTT, 50 mmol/L NaCl, 10 mmol/L TrisHCl (pH 7.5), 0.05 μg poly(dIdC)和40 g/L甘油，总体积为9 μL. 60 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶置真空干胶仪上真空干燥，－70℃放射自显影48 h. 上述实验重复3次. 结果用凝胶图像分析管理系统对电泳谱带进行半定量分析，取其面积与光密度值的乘积代表CREB的相对活性. 统计学处理： 用ScionImage软件和凝胶成像分析仪分别对Western和EMSA结果进行半定量分析. 用AU(Darea・Ddensity)代表条带的面积乘光密度值，表示目的蛋白的相对含量. 多组实验结果采用SPSS统计软件进行统计学分析. 数据用x±s表示，各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA)，用最小显著差异法(least significant difference, LSD)作两两比较，P<0.05为有统计学差异. 2结果 2.1PNS对吗啡戒断大鼠海马组织总CREB的影响实验结果表明：大鼠在慢性给予吗啡处理、纳络酮催促戒断及给予不同剂量PNS后海马组织总CREB的表达在各组之间有所不同，但与对照组相比均无显著性差异（P>0.05，表1，图1A）. 2.2PNS对吗啡戒断大鼠海马组织磷酸化CREB蛋白表达的影响慢性MOR组海马组织pCREB蛋白表达较对照组略有升高，但无统计学差异（P>0.05）. NAL组海马组织pCREB蛋白表达显著高于对照组和MOR组(P<0.01)，在给予吗啡的同时每kg体质量分别给予50，100，200，400 mg PNS之后可以显著降低海马组织的pCREB蛋白表达，并呈剂量依赖性，以400 mg/kg剂量组磷酸化水平降低最为显著（P<0.01，图1B，表1）. 表1PNS对吗啡戒断大鼠海马CREB、pCREB表达以及CREB/DNA结合活性的影响(略) aP<0.05, bP<0.01 vs对照组； fP<0.01 vs MOR； dP<0.01 vs NAL.对照：盐水处理组；MOR：单独给予吗啡处理组；NAL：纳洛酮催促戒断组；PNS50：PNS50 mg/kg治疗组；PNS100：PNS100 mg/kg治疗组；PNS200：PNS200 mg/kg治疗组；PNS400：PNS400 mg/kg治疗组；CREB：cAMP反应元件结合蛋白；pCREB：磷酸化CREB. 1：盐水处理组；2：单独吗啡处理组；3：纳洛酮催促戒断组；4：PNS 50 mg/kg治疗组；5：PNS 100 mg/kg治疗组；6：PNS 200 mg/kg治疗组；7：PNS 400 mg/kg治疗组. 图1Western blot检测PNS对吗啡戒断大鼠海马组织总CREBp(A)和CREB(B)的影响(略) 2.3PNS对吗啡戒断大鼠海马组织CREB/DNA结合活性的影响实验结果显示：吗啡依赖大鼠海马组织CREB/DNA结合活性与对照组相比无显著差异(P>0.05). 纳络酮催促戒断则使大鼠海马CREB/DNA结合活性显著高于对照组和MOR组(P<0.01，表1). 3讨论 慢性吗啡引起神经元可塑性和适应性改变的基础是转录因子调节某些靶蛋白表达，机体稳态重建的结果［2］. 转录因子CREB是脑内介导多个信号通路调节基因转录的主要核因子，其在脑组织内含量丰富，尤以神经元内居多［3］. CREB是首先发现的与药物成瘾密切相关的转录因子，其表达和功能是目前医学界研究的热点之一［4］. 慢性吗啡诱导的依赖、纳络酮诱导的戒断动物的中枢神经系统内以及某些细胞株的CREB磷酸化程度明显升高以及CREB/CRE结合活性增强，且其变化具有区域特异性，是衡量神经细胞活动程度的重要生化指标［5-6］. 而海马作为边缘结构则广泛地参与了学习与记忆过程，是参与成瘾记忆形成和强化的重要脑区［7-8］，因此本实验选取海马作为实验脑区. 结果证实，慢性给予吗啡、纳络酮催促戒断及不同剂量PNS各组CREB蛋白表达水平在海马组织有所不同，但与对照组相比均无显著性差异（P>0.05），吗啡依赖大鼠海马组织中CREB磷酸化水平及CREB/DNA结合活性有增高趋势，但无统计学意义，而纳络酮催促戒断大鼠海马组织中CREB磷酸化水平及CREB/DNA结合活性则明显的高于对照组和吗啡依赖组大鼠. 我们研究从蛋白水平和转录水平研究了PNS对吗啡依赖大鼠纳络酮催促戒断诱导的脑内转录因子CREB的影响，探讨了三七总皂甙缓解吗啡戒断症状的部分分子机制，研究结果为PNS的临床应用提供了必要理论依据. 【参考文献】 ［1］ 董明, 熊缨, 徐侃彦. 记忆增强肽促进大鼠海马内CREB磷酸化［J］. 生物化学与生物物理学报, 2000,32(6):575-580. ［2］ Nestler EJ. Molecular basis of longterm plasticity underlying addiction［J］. Nat Rev Neurosci, 2001,2(2): 119-128. ［3］ Noda Y, Nabeshima T. Learning/memory and drug dependence［J］. Nippon Yakurigaku Zasshi, 2002,119(4): 213-217. ［4］ Carrie L Walters， Julie A Blendy. Different requirements for cAMP response element binding protein in positive and negative reinforcing properties of drugs of Abuse［J］. Neuroscience, 2001,21(23): 9438-9444. ［5］ Ahmed BY, Yamaguchi F, Tsumura T, et al. Expression and subcellular localization of multifunctional calmodulindependent protein kinasesI, II and IV are altered in rat hippocampal CA1 neurons after induction of longterm potentiation［J］. Neurosci Lett, 2000,290(2): 149-153. ［6］ 张国忠,马春玲,苏彦君,等. 外源CRE顺式元件对慢性吗啡作用SKNSH细胞CREB蛋白表达及DNA结合活性的影响［J］.第四军医大学学报, 2005,26(6): 492-496. ［7］ Sarah B, Joseba P, Virginia A, et al. CREB (cAMP response element binding protein) in the locus coeruleus: Biochemical, physiological, and behavioral evidencefor a role in opiate dependence［J］. Neurosci,1997, 17(20): 7890-7901. ［8］ Gao C, Chen LW, Tao YM, et al. Effects of ohmefentanyl stereoisomers on phosphorylation cAMPresponse element binding protein in cultured rat hippocampal neurons［J］. Acta Pharmacol Sin, 2003,24(12): 1253-1259 |
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