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大鼠胰腺发育过程中Munc13           ★★★ 【字体：小 大】
大鼠胰腺发育过程中Munc13
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-9-30    
作者：袁庆新，刘超，滕丽萍，刘翠萍，周锦勇，郭靖，程梅， 德伟
【关键词】  胚胎胰腺发育
    Effect of Munc131 on insulin secretion during pancreatic development in rats
　　【Abstract】 AIM: To investigate the expression of Munc131 during various stages of embryonic pancreatic development in rats and define the effect of Munc131 on insulin secretion. METHODS: Pancreata of rat embryonic day 12.5 （E12.5）, E15.5, E18.5, newborn, 21 d after birth （P21） and adult rats were dissected under microscope respectively. In addition, the animal models of intrauterine growth retardation (IUGR) in rats were made by 50% calorie restriction in pregnant rats from gestational day 15 until term. After abstraction of totle RNA and protein, the techniques of RTPCR, realtime PCR, Western blot and ELISA were used to study the expression of Munc131 and insulin secretion. RESULTS: The genes of insulin and Munc131 began to be expressed from E12.5 and E15.5 respectively and their expressions were increased as the fetus grew. The result of Western blot showed that the expression of Munc131 was low at E15.5 and E18.5 and increased later. Blood insulin level was detected at E18.5 and increased rapidly thereafter. The blood insulin level and the expression of Munc131 were reduced simultaneously in IUGR models compared with normal newborn rats. CONCLUSION: The expression of Munc131 is accordant to blood insulin level and plays an essential role in insulin exocytosis.
　　【Keywords】 Munc131; insulin/secretion; embryonic pancreatic development; diabetes mellitus; IUGR
　　【摘要】 目的：研究大鼠胰腺发育不同阶段Munc131基因及蛋白表达的变化及Munc131在胰岛素释放过程中的作用. 方法：应用显微分离及提取技术获得大鼠胚胎发育12.5d（E12.5）,E15.5,E18.5,新生大鼠,出生后21 d（P21）及成年大鼠胰腺组织；另外，从大鼠胚胎发育15 d开始给予孕鼠半量饮食，造成宫内发育迟缓动物模型，提取其新生大鼠胰腺组织. 采用RTPCR, Realtime PCR和Western blot技术确定Munc131的表达情况，并测定不同发育时期血中胰岛素浓度. 结果：胰岛素基因从E12.5开始出现，Munc131基因从E15.5开始表达，随着胎龄的增长，二者表达量皆增多. E15.5和E18.5时munc131蛋白表达量较少，以后明显增多. 自E18.5即检测到血中胰岛素的存在，随着胚胎的发育，血胰岛素浓度逐渐升高. 宫内发育迟缓新生大鼠比正常新生大鼠血胰岛素浓度低，同时Munc131基因及蛋白表达量亦比正常对照组明显减少. 结论：Munc131在胰岛素释放过程中的作用，随着胚胎发育期胰岛素分泌的增多表达也增加，宫内发育迟缓新生大鼠胰岛素分泌减少时，Munc131的表达亦减少.
　　【关键词】 Munc131；胰岛素/分泌；胚胎胰腺发育；糖尿病；宫内发育迟缓
　　0引言
　　胰岛素在β细胞内合成后，以分泌颗粒的形式贮存在大致密囊泡中，在营养物质（葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等）、神经递质、激素等刺激下，进入血循环，完成其调节体内营养物质代谢，调节生长发育，控制血糖动态平衡的生理作用［1-2］. 业已证实，胞吐过程是涉及许多蛋白因子的复杂过程，可溶性N甲基马来酰胺融合蛋白附着蛋白受体(soluble nethylmaleimidesensitive fusion protein attachment protein receptors, SNARE)复合体是胞吐过程所必须的分子构件；Munc，Synaptotagmin，Rab等蛋白家族的不同成员是其重要的调节因子. 这些因子在神经递质胞吐中研究得较多，但他们在胰岛素分泌过程中的确切作用及其精细功能如何尚无定论［3-5］. 我们运用基因芯片技术，已建立了大鼠不同发育阶段基因表达谱，初步明确了胰岛素释放的完善过程中相关基因的表达情况，在此基础上，我们重点从胰岛素释放关键因子之一Munc131入手，探讨正常及异常胰腺发育情况下Munc131表达的变化，阐述其在胰岛素释放过程中所起的重要作用，以期寻找糖尿病治疗的新靶点.
　　1材料和方法
　　1.1材料SD大鼠由南京医科大学实验动物中心提供. 18：00将雌雄鼠合笼，次日晨检测有阴栓者定为孕0.5 d（E0.5），分别于受精后12.5 d(E12.5), 15.5 d(E15.5), 18.5 d(E18.5)，经颈椎脱臼处死孕鼠，剖腹取出孕子宫，分离胚胎，取出胰腺（E12.5,E15.5胚胎胰腺需在解剖显微镜下分离），新生鼠出生后，立即与母体分离，迅速取出其胰腺. 出生后21 d鼠和成年鼠在低温条件下迅速取出胰腺［6］. 部分孕鼠于E15开始给予正常卡路里的50%，直至出生，造成宫内发育迟缓动物模型，待新生鼠出生后，立即取出其胰腺. 所有标本置液氮中速冻后-70℃冻存备用. 分别取E12.5胚胎胰腺100只、E15.5胚胎胰腺30只，E18.5胚胎胰腺10只（来自3只孕鼠）,新生鼠3只（来自3只孕鼠），用Rneasy Mini Kit（Qiagen公司）抽提并纯化总RNA. 总RNA分装后-70℃冻存，用于RTPCR和Realtime PCR.
　　1.2方法RTPCR和Realtime PCR  RTPCR操作过程按试剂盒（日本Toyoko公司）提供常规步骤. 目的基因及内参照引物序列如下：G3PDH forward: 5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′, reverse: 5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′. Insulin forward: 5′CCGTCGTGAAGTGGAG3′, reverse: 5′CAGTTGGTAGAGGGAGCAG3′.  PDX1 forward: 5′GGTGCCAGAGTTCAGTGCTAA3′, reverse: 5′CCAGTCTCGGTTCCATTCG3′. Munc131 forward: 5′TGTGGAACAAGGGTCTCATCTGG3′. reverse: 5′GGCTGCGAAGTCGTGTAGTAAGG－3′. Munc131 RealtimePCR探针设计如下：unc13h1fam: CCAAGCCATGACCCACTTTGCCTG，unc13h1fp: CGCTATGGCGTTGAATCCA，unc13h1rp: TGCGTAGTAGGCGTTGATGTTG. 分别取E15.5的胰腺100只, E18.5的胰腺20只, 新生大鼠胰腺6只, 出生后21 d大鼠6只、成年大鼠6只（雌雄各3只），分别按1∶5（m/V）加裂解液（50 mmol/L TrisCl, 150 mmol/L NaCl, 1 g/L SDS, 100 mg/L PMSF, 10 g/L NP40, 10 g/L Triton X100, 10 g/L蛋白酶抑制剂cocktail），冰上匀浆，然后300 W超声4 s×14（间隔时间）×6次（保护、工作复位）， 静置1 h后，21 500 g离心15 min，提取上清为总蛋白，用Braford法测蛋白浓度，分装后-70℃冻存备用. 将上述提取的胰腺发育各时期的总蛋白,进行SDSPAGE,转膜后以Munc131（小鼠，针对621~834氨基酸，BD公司）为一抗，羊抗小鼠IgG为二抗进行杂交，检测其相对分子质量. 另取E18.5、新生大鼠和成年大鼠血标本各6份，运用胰岛素ELISA试剂盒（Linco公司）检测血中胰岛素水平.
2结果
　　胰腺内分泌细胞的一些标志物如insulin，PDX1等基因在所取胰腺皆有表达，证明我们的取材是准确无误的.
　　2.1胰腺发育各阶段Munc131基因及蛋白的表达Munc131从E15.5开始表达，以后一直持续存在；同时，胰岛素基因从E12.5开始出现，随着胎龄的增长表达量增多（图1）. Realtime PCR结果与RTPCR结果趋势一致. Western blot结果显示，在Mr 1.97×105处出现杂交带,此与文献报道的Munc131抗原的相对分子质量相一致. E15.5和E18.5时Munc131蛋白表达量较少，新生以后表达量明显增多.
　　M：Marker；N：新生大鼠；P21：出生后21 d大鼠；A：成年大鼠.
　　图1大鼠胰腺中Munc131,insulin的表达（RTPCR）（略）
　　A: 正常大鼠；  B: 宫内发育迟缓新生大鼠. N：新生大鼠； IUGR：宫内发育迟缓新生大鼠.
　　图2胰腺中Munc131蛋白的表达（Western blot）（略）
　　2.2宫内发育迟缓新生大鼠Munc131基因及蛋白的表达与正常新生大鼠相比，宫内发育迟缓新生大鼠insulin基因表达无明显变化，PDX1表达相对减少，而Munc131的基因表达明显减少（图3）. 宫内发育迟缓新生大鼠Munc131蛋白表达量比正常对照组明显减少（图2B）.
　　N: 正常新生大鼠；IUGR：宫内发育迟缓新生大鼠.
　　图3正常及宫内发育迟缓新生大鼠insulin，PDX1，Munc131的基因表达（略）
　　2.3大鼠不同发育阶段血胰岛素水平自E18.5即检测到血中胰岛素的存在，但浓度较低，随着胚胎的发育，血胰岛素浓度明显升高，新生和成年期血胰岛素水平无显著差异. 另外，宫内发育迟缓新生大鼠比正常新生大鼠血胰岛素浓度低.
　　3讨论
　　胞吐是胰岛素释放出β细胞的重要过程. 胰岛素分泌颗粒分别位于贮存池（约95%～99％）和释放池（约1%～5％），释放池的胰岛素颗粒经过胞吐介导一相胰岛素分泌，贮存池的胰岛素颗粒经过转位、锚定、成熟等过程，补充释放池的不足，完成二相胰岛素分泌. 虽然循环胰岛素的量与胰岛素合成有关，但与胰岛素释放的调节关系更加密切［7-9］，本实验室最近的结果显示，上述胰岛素分泌关键因子在胚胎及成年大鼠胰腺有表达（结果未列），为明确各关键因子的具体作用，我们首先选择了Munc131作进一步的研究. Munc家族成员中较重要的是Munc13（包括Munc131，Munc132，Munc133）和munc18. 有研究提示，Munc131不仅可以与Munc18结合，使Munc18与syntaxin解离，还能直接作用于syntaxin，使syntaxin从syntaxinMunc18复合体中游离出来，此时SNARE复合体才能从没有胞吐能力的松散状态变成致密复合体，促使胞吐的发生［10-12］. 但Munc131在胰岛素分泌过程中的确切作用显有报道，对其胚胎发育期的研究更是少. 我们发现，大鼠E12.5胰岛素基因即开始表达，Munc131从E15.5开始出现，说明胚胎胰腺发育早期即有了合成胰岛素的能力，随后才出现胰岛素胞吐关键调节基因，随着胚胎的生长，二者表达量增多. Munc131蛋白在E15.5，E18.5已有少量表达，出生以后表达明显增多，与基因水平表达趋势基本一致. 另宫内发育迟缓新生大鼠比正常新生大鼠血胰岛素水平降低，从基因水平及蛋白水平上看，宫内发育迟缓新生大鼠比正常新生大鼠Munc131的表达明显减少，而胰岛素基因的表达无明显变化，这提示宫内发育迟缓新生大鼠胰岛素的合成能力可能不变，其血胰岛素水平下降可能发生在胰岛素释放的环节，即可能是Munc131等胞吐调节因子表达下降，从而造成胰岛素胞吐能力减弱，导致循环胰岛素减少.
　　因此，我们可以得出以下结论：① 大鼠胚胎胰腺有分泌胰岛素的能力，以调节自身血糖水平，但胚胎发育晚期才开始有较多的胰岛素分泌，且随着胚胎生长，胰岛素分泌增多；② Munc131在胰岛素释放过程中起着重要作用，随着胚胎发育期胰岛素分泌的增多，Munc131的表达同时增多，而宫内发育迟缓新生大鼠胰岛素分泌减少时，Munc131的表达亦减少.
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