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高温联合辐射对胚胎神经发育及脑热应激蛋白的影响           ★★★ 【字体：小 大】
高温联合辐射对胚胎神经发育及脑热应激蛋白的影响
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-9-30    
【关键词】  高温；辐射；孕鼠胚胎；神经发育；脑热应激蛋白质
　　【摘要】 目的  探讨高温联合辐射致胚胎神经发育与早期胚胎脑蛋白质和HSPs表达的关系。 方法  将130只孕鼠按随机抽签分为13组，每组10只。在鼠妊娠第8d，第9d分别接受60Co及γ-射线全身照射各1次,照射剂量1.0Gy；第10d各置温箱中,分别使其肛温保持在37±0.5℃，41±0.5℃，42±0.5℃,并持续3，4，5min。移出温箱2h后，每组每时段随机取5只脱颈法处死，采用Western dot blot 和lowry方法定量分析胚胎脑HSP70和蛋白质含量与胚胎神经系统畸形。 结果  高温联合辐射对胚胎神经毒性明显增加，并与高温强度及作用时间呈正相关；高温联合辐射作用于胚胎早期对胚胎脑蛋白质降低有复合作用（P＜0.01），并可诱导脑HSP70合成。 结论  高温与辐射联合致神经发育与胚胎脑蛋白质合成及热应激蛋白的诱导有一定的相关性。
　　【关键词】 高温；辐射；孕鼠胚胎；神经发育；脑热应激蛋白质
　　Effects of hyperthermia combined with radiation on embryonic nervous development and heat shock protein of brain
　　【Abstract】 Objective  To explore the relation between the embryonic nervous development induced by hyperthermia combined with radiation and early embryonic brain proteins or HSPs' expression. Methods  130 pregnant mice were randomly divided into 13 groups( each n= 13).On the 8th  and  9th  day of pregnance, the mice received one time of general irradiation of 60Co and γray respectively, the dosage of irradiation was 1.0 Gy;on the 10th  day ,the mice were put in  hotboxes  keeping their rectal temperature at 37±0.5℃, 41±0.5℃ and 42±℃0.5℃ persisting for 3,4 and 5 mins, respectively. After two hours of the mice leaveing warming boxes, 5 mice randomly selected from each group per timesection were executed by cervical vertebra luxation. The HSP70 of embryonic brain, protein content and deformations of embryonic nervous systems were quantitatively analyzed with the Western dot blot and Lowry method. Results  The toxicity of hyperthermia combined with irradiation to embryos markedly increased and was positively related to hyperthermia intensity and duration; hyperthermia with irradiation had compound action on reducement of embryonic brain proteins in early embryo (P<0.01) and induced the synthesis of brain HSP70. Conclusion There was certain relativity of nervous development induced by hyperthermia combined with irradiation and synthesis of embryonic brain proteins or induction of HSP70.         
　　【Keywords】 Hyperthermia; radiation;embryo of pregnant mice; nervous development; the HSPs   
　　胚胎、组织器官和细胞对各种异常生理环境做出应答反应的主要产物之一是热休克蛋白基因编码的热应激蛋白(heat shock protein,HSPs)合成增多,HSPs和脑蛋白质含量变化能准确反映脑分化和脑损伤程度，文献报道多为单一的高热或电离辐射可能对胚胎和神经系统发育产生效应。本研究试图探讨高温与辐射联合对胚胎神经系统畸形的影响，为人类的优生优育提供科学依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验对象  选取由河南省实验动物中心繁育提供的健康未生育的SD雌性大鼠(体重190～210g)和雄性大鼠(225～275g)为实验对象。
　　1.2 妊娠确定  动情期雌雄鼠按2:1合笼过夜，次日晨检查雌鼠，以发现阴栓为妊娠依据，并定为怀孕第0d。确定入组孕鼠130只。 
　　1.3 分组与处理  将130只孕鼠按随机抽签分成13组，每组10只。于妊娠第8，9d分别接受60Co及γ-射线全身照射各1次，剂量1.0Gy；第10d每组各置温箱中,分别使其肛温保持37±0.5℃，41±0.5℃，42±0.5℃,并持续3，4，5min。孕鼠移出温箱2h后，每组随机取5只，脱颈法处死，取出胎鼠，取全脑组织制备匀浆［1］，测量HSP70和蛋白质；18d后每组随机取5只，脱颈法处死，消毒后剖腹，解剖镜下依次剥离蜕膜、Reicherts膜、卵黄膜和羊膜，然后将分离的胚胎置于光镜下观察胚胎神经系统畸形状况。         
　　1.4 脑蛋白质与HSP70检测 
　　1.4.1脑蛋白质检测  取匀浆上清液5μL按Lowry氏法［2］测定总蛋白含量。1.4.2 HSP70检测  以Western dot bot方法［3］，用已知HSP70 300mg・L-1配成100mg・L-1、50mg・L-1、25mg・L-1、12.5mg・L-1、6.25mg・L-1参照系列，与样品同步点样于同一个定量型硝酸纤维素滤膜（浙江省黄岩市四清生化材料厂产）上，制成免疫印渍膜。用兔抗人HSP70单克隆抗体及辣根过氧化物酶二氨基联苯胺法显色，终止反应后迅速照相和扫描（CS930扫描仪，460nm波长），根据参照系列HSP70浓度的光密度计算每毫克脑组织蛋白HSP70含量(μg・mg.prot)。
　　1.5 统计方法  所有数据运用SPSS11.0统计软件包处理,以均数±标准差(±s)表示,组间各时断数据采用t检验。
2 结果
　　2.1  高温联合辐射对孕鼠胚胎神经系统发育的影响，见表1。
　　表1  高温、辐射对孕鼠胚胎神经系统的影响（略）
　　注：*与37℃温度组比较P<0.01；**与单独高温组比较P<0.01
　　　
　　表2  高温与辐射对鼠妊娠胚胎脑蛋白质及HSP70的影响（略）
　　注：*与单独高温组比较P<0.01
　　   
　　表1显示，在鼠妊娠第8，9d，高温联合辐射对胚胎神经系统毒性明显增加，并与高温强度及作用时间呈正相关，神经管未闭、体位异常、脑形态异常因子差异有极显著性（P<0.01）。
　　2.2 高温与辐射对鼠妊娠胚胎脑蛋白质及HSP70含量的影响，见表2。
　　
　　表2显示，鼠妊娠在高温及高温联合辐射可导致胎脑蛋白质含量下降,诱导HSP70大量合成；42℃组与37℃组比较诱导HSP70合成差异有极显著性（P＜0.01)；高温联合辐射组胎脑蛋白质含量下降有明显变化,并与温度呈正相关,差异有极显著性（P＜0.01)。
　　3 讨论
　　
　　高温在自然环境与劳动环境中频繁出现，某些疾病也常伴有发热，而随着放射性元素在医学和工业生产中的应用以及核能事业的发展，怀孕早期的妇女在工作、生活以及疾病等情况下经常会暴露于高温、辐射，或两者复合作用之下，处于分化中的神经器官对致畸因子最敏感。流行病学调查推测，高温可能是引起人类神经系统畸形的重要环境因素。发育中的大脑对辐射具有特殊的敏感性，正常的大脑发育中大量地存在程序化细胞死亡，其可被电离辐射加速或改变［4］。据文献报道［5，6］热处理孕8.5～10.5d的大鼠畸胎发生率明显高于热处理＜8.5d或＞10.5d的大鼠的畸胎发生率。本研究显示，在鼠妊娠第8，9d，高温联合辐射对胚胎神经毒性明显增加，并与高温强度及作用时间呈正相关，神经管未闭、体位异常、脑形态异常因子差异有极显著性（P<0.01）。提示胚胎神经系统发育对高温与辐射联合的敏感性提高。
　　
　　大脑是体内最复杂，对环境最敏感的器官，其神经元不能再生，脑蛋白质含量的变化能及时反映细胞数量及细胞分化和功能情况，同时HSP70的合成与早期胚胎大脑的生长发育和异常的发生存在着内在联系［7］，测量胎脑蛋白质及HSP70的变化是了解环境因素对早期胚胎大脑损伤程度的有效手段。本研究表明，鼠妊娠在高温及高温联合辐射可导致胎脑蛋白质含量下降,诱导HSP70大量合成；42℃高温组与37℃组比较HSP70的合成有明显差异，说明高温对大脑有一定刺激，诱导合成HSP70对脑细胞进行保护；42℃高温(＞3min)联合辐射与37℃组比较，二项指标均有显著差异，与单独42℃比较蛋白质含量明显下降，诱导HSP70合成并无明显增加，提示辐射联合高温42℃(＞3min)对胎脑蛋白质降低有复合作用，胎脑HSP70的合成水平没有明显变化。辐射可以诱导胎脑HSP70表达，但其诱导作用不如高温明显，高温联合辐射并不能增加单独高温或单独辐射作用下诱导HSP70合成水平。表明应激达到一定强度后，增加刺激并不能提高胎脑HSP70的合成水平，与文献报道［5，6］结果相一致。提示上述因素影响胎脑蛋白质合成而引起脑细胞损伤严重，一方面诱导HSP70合成，同时又因结构破坏使合成受抑制，HSP70对细胞保护程度不够而导致中枢神经系统发育不良，机体表现为神经系统发育异常。胎脑蛋白质含量的下降和诱导HSP70的合成的变化规律与高温变化，持续时间，辐射及二因素联合所致神经发育结果基本一致，在胚胎发育过程外界环境因素引起的胎脑抗损伤与损伤受相关基因协调，如果协调出轨，HSP70对胚胎细胞保护强度不够，导致胚胎中枢神经系统细胞发育异常，机体表现为神经系统发育异常。
　　参考文献
　　［1］ 芦春林，Kimme CAKmel GL,等.高温致胚胎发育毒性机理的研究［J］.北京医科大学学报，1993，25(6)：435
　　［2］ Sun XQ, LI JS, Wu XY. The express of heat shock protein70 in rat brain after GZ exposure［J］. J Gravit physio，2002，9(1)：23
　　［3］ Fisher BR,Brown NT,Heredia,D J.et al.Occipotal encepalocele and early gestational hyperthemia［J］.Teratology，1995，52：90
　　［4］ 高卫民，周湘艳.出生前氚水照射对仔代大鼠生长发育及神经行为的影响［J］.中华放射医学与防护杂志，1998，18（6）：381
　　［5］ Novey L，Scharrf KD. Heat stress proteins and transcription factors cell［J］.Mol. Lifesci，1997，53：80
　　［6］ Chen H, Liu Z, Zhou Z, Jiang M, Qian L, Wu S.The regulatory effect of memantine on expression and synthesis of heat shock protein 70 gene in neonatal rat models with cerebral hypoxic ischemia［J］.Chin Med J.2003，116(1)：558
　　［7］ Mirkes PE. Hypothermia and the induction of neural tube defects in mices［J］.Teratology，1994，4
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